漸凍癥的治療方法：間充質干細胞和細胞外囊泡的作用

肌萎縮性側索硬化癥 (ALS) 是一種致命的神經退行性疾病（漸凍癥），其特征是進行性肌肉麻痹，這是由運動皮質腦干和脊髓中的運動神經元退化決定的。ALS 的發病機制仍不清楚，盡管大量研究表明涉及幾種改變的信號通路，例如線粒體功能障礙、谷氨酸興奮性毒性、氧化應激和神經炎癥。

迄今為止，所提出的治療策略針對的是這些改變中的一個或幾個，對ALS患者的病程和存活率的影響很小。ALS發病機制中不同機制的參與強調了針對多個方面的治療方法的必要性。間充質干細胞 (MSC) 可以支持運動神經元和周圍細胞，減少炎癥，刺激組織再生并釋放生長因子。在此基礎上，間充質干細胞被提議作為治療漸凍癥的有前途的候選者。然而，由于細胞療法的缺點，干細胞釋放的細胞外囊泡 (EV) 的可能治療用途引起了越來越多的興趣。

意大利維羅納維羅納大學神經科學、生物醫學和運動科學系綜述總結了肌萎縮性側索硬化癥的主要病理機制和迄今為止提出的相關治療方法，重點是間充質干細胞治療漸凍癥的臨床應用。此外，討論了EV的性質和特征及其在概括干細胞作用中的作用，闡明了這些囊泡如何以及為什么可以為肌萎縮性側索硬化癥治療提供新的機會。MSC已被提議作為治療 ALS的有前途的候選者。

肌萎縮性側索硬化癥的發病機制

鑒定ALS中運動神經元退化的分子機制對于理解疾病進展和開發新的治療方法至關重要。盡管SOD1突變與ALS相關已有二十多年，但突變體SOD1的作用模式和隨后的神經變性/神經毒性的潛在機制仍不清楚。在這方面已經提出了幾個假設，并且看起來可能是機制的組合，而不是單一的機制，導致了ALS的神經變性，指向多因素的發病機制（圖1)。

圖1：肌萎縮側索硬化癥 (ALS) 的發病機制。該疾病的病理生理機制似乎是多因素的，有幾種機制導致神經變性。

• 線粒體功能障礙：線粒體損傷是許多神經退行性疾病的共同特征。
• 谷氨酸興奮性毒性：谷氨酸是中樞神經系統 (CNS) 中的主要興奮性神經遞質，在突觸前末梢合成并擴散到突觸間隙，激活特定的突觸后受體并觸發動作電位。
• 氧化應激：自由基或 ROS 是氧代謝的天然產物。當 ROS 的產生高于細胞去除它們的能力時，使用術語氧化應激。這導致 ROS 的積累，從而對細胞結構和大分子（例如蛋白質、DNA 和 RNA）造成不可逆轉的損害。
• 蛋白質聚集體：蛋白質聚集體是許多神經退行性疾病的病理學標志，例如阿爾茨海默氏癥、帕金森氏癥、亨廷頓舞蹈癥和肌萎縮側索硬化癥。
• 神經絲的積累：NFs在細胞體和軸突中的積累和/或聚集，以及磷酸化NFs在細胞體中的異常定位是ALS的典型病理標志。
• 神經炎癥：ALS和其他神經退行性疾病的一個共同特征是神經炎癥反應，其特征是神經元損傷部位的小膠質細胞活化、星形膠質細胞增生和免疫細胞浸潤。

肌萎縮性側索硬化癥的治療方法

鑒于肌萎縮性側索硬化癥發病機制的復雜性，迄今為止還沒有有效的治療方法來治愈或顯著改善患者的生活質量。盡管如此，已經提出了幾種治療策略來緩解漸凍癥患者的癥狀并改善其生活質量。

藥物治療

1994年利魯唑被批準用于治療漸凍癥，但它只能延長大約3個月的壽命。2017年，一種新藥依達拉奉在美國注冊。目前，利魯唑和依達拉奉(Radicava?)是唯一被FDA批準的治療藥物。雖然這些藥物對生存有一定的益處，但終不能實現逆轉或者治愈。

干細胞療法

干細胞正在成為神經元替代和再生的一種有前途的治療方法，成為患有不同神經退行性疾病（包括肌萎縮性側索硬化癥）的患者寄予厚望和期待的源泉。干細胞作為治療方法的使用引起了極大的興趣，因為它們能夠歸巢到受損部位，刺激組織修復和再生，并指導它們響應細胞外信號進行分化。

干細胞是一組具有自我更新能力和分化成多種細胞類型的細胞。它們通常分為兩大亞型： 胚胎干細胞 (ESC)，起源于囊胚的內細胞團，具有產生所有三個胚層的能力；成體干細胞，可以分化成不同器官的多種細胞類型的特化細胞，通常由起源的胚層決定。在不同的干細胞類型中，最常用于神經系統疾病的是：ESC、神經干細胞 (NSC)、MSC 和誘導多能干細胞 (iPSC)。干細胞的最佳來源應根據其生存、遷移至受損組織、移植和分化的生物學特性來選擇。

干細胞治療的主要目標是細胞替代和神經保護。第一個目標將通過干細胞分化成與疾病有關的特定細胞亞型來實現，目的是替換死細胞。第二個目標涉及基于干細胞釋放營養因子和去除神經毒性分子的能力的干細胞的使用，在受損區域的微環境中提供局部支持，充當神經保護者。

在用于治療神經退行性疾病的不同類型的干細胞中，間充質干細胞作為有前途的候選者似乎引起了最高的興趣。MSC可以從多種胎兒和成人組織中分離出來，例如骨骼肌、胎盤、臍帶、血液和脂肪組織。脂肪組織越來越受到關注，因為它可以從吸脂術中大量獲得，從而允許脂肪來源的MSC (ASC) 的自體移植。

MSC的應用有幾個技術優勢。首先，它們的分離是安全和容易的，它們在體外的擴增很簡單，而且在體外和體內都證明它們可以分化成神經樣、神經膠質樣和星形細胞樣細胞。考慮到自體移植的可能性，MSC 對腫瘤變化的敏感性較低，并且不需要免疫抑制治療來防止排斥反應。此外，與其他干細胞一樣，移植和遷移后，MSC會被吸引到受損區域，在那里它們會增加神經營養因子的釋放。

干細胞移植治療漸凍癥的臨床試驗

在過去的幾年中，許多基于細胞的ALS臨床試驗都使用了MSC，并報告了MSC對ALS患者給藥的可行性、安全性和免疫學效果（表2)。

干細胞類型	移植方式/細胞數量	試用狀態和詳細信息	參考
自體骨髓間充質干細胞	椎管內（14–60×106個細胞）	該方法安全可行。一些患者表現出神經肌電圖改善	德達等人(2009)
自體骨髓間充質干細胞	鞘內（54.7×106±17.4×106個細胞） 靜脈內（23.4±6×106個細胞）	該方法安全、可行，并可立即產生免疫調節作用。I期完成，II期開放以評估不同劑量細胞的初步效果	Karussis 等人(2010年)
自體骨髓間充質干細胞	椎管內（15–110×106個細胞）	該方法安全可行，沒有毒性、不良事件或異常細胞生長的跡象。第一階段完成；無長期有害后果，但疾病進展似乎并未減緩	馬志尼等人( 2010); 馬志尼等人。(2012)
自體骨髓間充質干細胞	椎管內（138–602.87×10 6 個細胞）	該方法安全可行。尸檢后未發現衰退加速，脊髓運動神經元數量增加	布蘭克等人(2012)
自體骨髓間充質干細胞	腦室內（1×106個細胞/kg）	該方法安全可行	貝克等人(2012)
自體骨髓間充質干細胞	運動皮層（2.5–7.5×105個細胞）	該方法安全可行，接受治療的患者具有更高的顯著生存率	馬丁內斯等(2009); 馬丁內斯等。(2012)
自體BM-MSC和神經誘導的MSC	靜脈內（42–102×106個細胞）和腰椎內（5–9.7×102×106個細胞）	該方法安全，延緩疾病進展，提高患者生活質量	Rushkevich等人(2015年)
自體骨髓間充質干細胞	鞘內（1–2×106個細胞） 肌內（1–48×106個細胞）	該方法安全可行。I期完成，II期開放以評估不同劑量細胞的初步效果	彼得魯等人( 2016 年)

然而，盡管干細胞介導的療法代表了一種治療ALS和其他神經退行性疾病的新方法，但迄今為止，與安慰劑治療的對照相比，尚未獲得對疾病進展的顯著影響，并且在廣泛的臨床轉化之前需要解決關鍵問題。

首先，有必要使用標準化協議確定細胞向CNS的輸送，并考慮給藥途徑、細胞劑量、時間和細胞注射次數。此外，鑒于干細胞的高增殖能力，應防止移植細胞的致癌轉化并避免其免疫排斥。

在證明只有一小部分注射的干細胞可以到達損傷部位、移植和分化后，干細胞的有益作用是間接的并且很可能取決于它們的旁分泌活動的想法變得越來越普遍。干細胞產生大量含有細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白質和核酸的EV，并且可以對細胞產生顯著影響，介導細胞間通訊。這些觀察結果導致了這樣的假設，即干細胞通過分泌EV發揮其有益作用，從而增強受損區域釋放其內容物的修復。因此，EV可以用作一種新型的無細胞治療方法，避免與使用細胞相關的所有風險。

細胞外囊泡

細胞間通訊在多細胞生物中起著重要作用。它可以通過細胞之間的直接接觸或通過分泌分子（例如生長因子、趨化因子和細胞因子）來介導，從而對附近的細胞產生影響。在過去的幾十年中，提出了一種新的細胞通訊機制，涉及EV的細胞間轉移。這些囊泡代表了在細胞之間轉移膜和細胞質蛋白質、脂質和核酸的載體，成為細胞間微環境的組成部分，并在許多生理和病理過程中發揮作用。

外泌體的治療應用

由于外泌體和微泡可以遠距離傳遞生物信息，因此越來越多的人關注這些囊泡作為病理過程抑制因子的促進劑。由于外泌體比微泡小并且能夠穿過血腦屏障，在這里我們將重點關注外泌體作為神經退行性疾病（例如肌萎縮性側索硬化癥、阿爾茨海默氏癥和帕金森氏病）的潛在治療工具的用途。

越來越多的證據表明外泌體具有抗炎特性，可減少活化的炎癥小膠質細胞的數量，支持少突膠質細胞并保護神經元。此外，鼻內注射的外泌體被迅速輸送到大腦，在那里它們可以被小膠質細胞吸收。由于如上所述，神經炎癥是神經退行性疾病的共同特征，神經炎癥反應的抑制和容易到達中樞神經系統的可能性對于治療這些病癥非常重要。

使用外泌體治療神經退行性疾病的越來越多的關注源于外泌體穿過血腦屏障的能力，血腦屏障是將腦實質與中樞神經系統中的循環血液分開的生理屏障。如前所述，目前對神經退行性疾病的治療通常是有癥狀的，不會阻止退化過程；治愈這些病癥的主要問題是細胞和藥物無法穿過血腦屏障。最近的研究報告說，與微泡不同，外泌體可以穿過血腦屏障：假設是外泌體被內皮細胞內化，并且通過釋放特定的貨物，它們影響細胞連接的完整性，增加細胞之間的滲透性并允許大量進入中樞神經系統中的囊泡，在那里他們可以發揮神經保護作用（圖2)。

結論和未來展望

科學界對間充質干細胞作為神經退行性疾病的潛在治療方法的興趣是由于它們能夠遷移到受損組織、分化并促進修復過程。除了這些特點，ASC也很容易獲得，可用于自體移植，避免可能的細胞排斥反應。這些特性使ASC 成為基于細胞替代和細胞分化的細胞療法的候選者。由于ASC的有益作用可能是由于旁分泌活動而不是它們的植入，因此科學界已將重點從細胞轉移到EV，由于其內容，EV可以重現ASC效應，并可能為用于治療ALS的非細胞療法。這種創新療法很容易轉移到ALS患者身上，因為EV將從自體ASC中獲得，并且會保留其來源的免疫特性，避免免疫原性反應。

鑒于EV可能應用于ALS，囊泡需要穿過BBB才能到達損傷部位，并且在EV中，外泌體具有所需的特性。為了測試外泌體在ALS中的作用，我們最近證明，在ALS的體外模型中施用外泌體在氧化損傷后發揮神經保護作用，支持外泌體可以概括和改善干細胞療法的神經保護作用的觀點。

主要參考資料：

[1]:Bonafede R, Mariotti R. ALS Pathogenesis and Therapeutic Approaches: The Role of Mesenchymal Stem Cells and Extracellular Vesicles. Front Cell Neurosci. 2017 Mar 21;11:80. doi: 10.3389/fncel.2017.00080. PMID: 28377696; PMCID: PMC5359305.

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